Corsi di studio in
Farmacia - Chimica e tecnologia farmaceutiche

acquisizione delle conoscenze di base circa le metodologie applicate nella sperimentazione biochimica e biochimica clinica con particolare attenzione per la logica dell'impostazione degli esperimenti e della raccolta dati

Gli studenti dovrebbero acquisire le conoscenze di base delle principali metodiche e strumentazione utilizzate nei laboratori biochimici e di analisi cliniche ed essere in grado di progettare esperimenti e risolvere i problemi pratici relativi all'identificazione, analisi e studio di funzioni delle biomolecole

Programma  CFU 5

Introduzione alle metodologie biochimiche

Biochimica e' una scienza sperimentale, progettazione di esprimenti.

Enzimologia e inibizione

Enzimi come catalizzatori biologici e loro caratteristiche chimiche, coenzimi e gruppi prostetici, siti attivi (teorie della chiave serratura e dell'induce fit), barriera energetica, Cineitche enzimatiche di saturazione, ruolo del complesso ES, equazione di Michaelis e Menten, I significati di Km e Vmax, grafici del doppio reciproco, Inibizione competitiva, non competitiva e acompetitiva, ruolo de pH, allosteria

 Preparazione e manipolazione di campioni biologici.

Uso e preparazione di soluzioni tampone. Rottura di cellule; preparazione e purificazione di organelli cellulari; centrifugazione: centrifughe, rotori, centrifugazione differenziale e di isodensità all'equilibrio con esempi applicativi (separazione di organelli cellulari, purificazione di acidi nucleici in gradiente di sali). 

 Colture cellulari.

Colture primarie, secondarie, linee. Metodiche colturali. Tecniche cromatografiche ed elettroforetiche applicate all'isolamento, alla purificazione e all'analisi di sostanze di interesse biochimico e biochimico-clinico.  

Procedure preliminari per la purificazione delle proteine

 considerazioni generali (resa di una purificazione), metodi di omogeneizzazione dei tessuti (metodi meccanici e non), precipitazione frazionata delle proteine (salting in and salting out)

 Metodologie per la purificazione delle proteine: Tecniche cromatografiche:

Generalità e definizioni.  Caratteristiche ed applicazioni delle cromatografie: di scambio ionico, di esclusione dimensionale (con esempi di determinazione del peso molecolare di proteine), di bioaffinità (con esempi di ligandi e strategie generali per il legame covalente dei ligandi alla fase stazionaria), di interazione idrofobica, di chelazione.

 Tecniche per l'analisi di proteine: Tecniche elettroforetiche:

principi generali: concetto di mobilità elettroforetica e relazione tra mobilità, carica, campo elettrico applicato, dimensioni. Relazione tra punto isoelettrico e mobilità delle proteine. Elettroforesi su strisce di acetato di cellulosa e separazione di siero proteine, tracciati patologici; elettroforesi su gel di poliacrilammide ( SDS-PAGE).  Tecniche di trasferimento di macromolecole dai gel (in particolare la tecnica del Western Blot). Isoelettrofocalizzazione. Elettroforesi bidimensionale (applicazioni allo studio del proteoma). Elettroforesi di acidi nucleici.                                                

 Metodi spettrofotometrici

Per lo studio delle molecole biologiche ed in enzimologia: generalità e definizioni. Spettri di assorbimento con esempi di spettri di molecole di interesse biochimico: proteine, acidi nucleici, NAD, citocromo c, citocromo P-450. Legge di Lambert-Beer e dosamenti quantitativi. Esempi di dosamenti: dosamento delle proteine e di enzimi: unità di attivita' enzimatica, attività specifica, fattore di arricchimento durante una purificazione. Saggi enzimatici in cinetica ed a tempo fisso.  Esempi di determinazione di attività enzimatiche    Fluorimetria ed applicazioni in biochimica e microscopia delle cellule e tessuti. Luminometria e sistema luciferina-luciferasi. Dosamento spettrofotometrico del DNA.

Principi di base della risonanza magnetica nucleare e della sua applicazione con le proteine.

Esempi di purificazione di proteine

Purificazione della DNA polimrasi da Thermus aquaticus, purificazione da Escherichia coli,

purificazione usando his-tag, purificazione di proteine da membrana, purificazione da organi e dalle cellule di mammifero HEK293

 Saggi immunologici.

Nozioni su antigene e anticorpo, anticorpi monoclonali e loro preparazione. Sistemi di dosamento immunologico basati sulla immunoprecipitazione e sulla marcatura di antigeni od anticorpi con enzimi (ELISA) e (RIA).

Metodi biochimici nell'analisi delle interazioni molecolari

Equilibri di legami, legame ad un unico sito, la competizione di legame, il legame non specifico, la cinetica di legame, analisi sperimentale degli equilibri di legame (metodi spettroscopici, metodi basati sulla separazione molecolare, risonanza plasmonica di superficie)

Metodi per l'analisi delle interazioni proteina-proteina

Cromatografia di affinita', co-immunoprecipitazione, cross-linking, cenni sui metodi generici

Microarray e sue applicazioni 

 metodo che permette di valutare il profilo di espressione di migliaia gi gene simultaneamente per studiare l'effetto di certi ttattamenti, malattie.