Corsi di studio in
Farmacia - Chimica e tecnologia farmaceutiche

Biochimica applicata - CTF

Anno accademico 2008/2009

Sommario insegnamento

• Obiettivi formativi
• Programma
• Testi consigliati e bibliografia
• Note
• Strumenti didattici

Obiettivi formativi

Programma

Programma:  Preparazione e manipolazione di campioni biologici. Uso e preparazione di soluzioni tampone. Rottura di cellule; preparazione e purificazione di organelli cellulari; centrifugazione: centrifughe, rotori, relazione tra numero di g e rpm, centrifugazione differenziale e di isodensità all'equilibrio con esempi applicativi (separazione di organelli cellulari, purificazione di acidi nucleici in gradiente di sali di cesio). Metodi spettrofotometrici.: generalità: definizione di lunghezza d'onda, frequenza. Unità di misura e regioni dello spettro. Spettri di assorbimento con esempi di spettri di assorbimento di sostanze di interesse biochimico: proteine, acidi nucleici, NAD, citocromo c, citocromo P-450. Funzioni e meccanismo catalitico del citocromo P-450. Spettri differenziali e loro uso per lo studio delle interazioni citocromo-ligandi.  Legge di Lambert-Beer e dosamenti quantitativi. Esempi di dosamenti: dosamento delle proteine (assorbanza a 280 nm, metodi di Lowry e del biureto): dosamenti di attività enzimatiche: unità di attivita’ enzimatica, attività specifica, fattore di arricchimento durante una purificazione. Saggi in cinetica ed a tempo fisso. Relazione tra v_0,V_max e concentrazione di un enzima. Esempi di determinazione di attività enzimatiche: citocromo c reduttasi, lattico deidrogenasi, maltasi, proteasi. Utilizzo di reazioni accoppiate con enzimi deidrogenasici NAD-dipendenti: esempio dosamento di transaminasi. Utilizzo di enzimi come "reattivi" per il dosamento di metaboliti: esempio determinazione quantitativa del colesterolo.     Fluorimetria ed applicazioni in biochimica. Luminometria e sistema luciferina-luciferasi per il dosamento di ATP. Dosamento spettrofotometrico del DNA e studio della temperatura di fusione di un DNA. Tecniche cromatografiche ed elettroforetiche applicate all’isolamento, alla purificazione e all’analisi di sostanze di interesse biochimico e biochimico-clinico. Tecniche cromatografiche: Generalità e definizioni. Tecniche cromatografiche particolarmente usate per la separazione di biomolecole. Polimeri utilizzati per le fasi stazionarie. Caratteristiche ed applicazioni delle cromatografie: di scambio ionico, di esclusione dimensionale (con esempi di determinazione del peso molecolare di proteine), di bioaffinità (con esempi di ligandi e strategie generali per il legame covalente dei ligandi alla fase stazionaria), di interazione idrofobica, di chelazione (IMAC) e covalente. Esempi di strategie di purificazione di proteine. Tecniche elettroforetiche: principi generali: concetto di mobilità elettroforetica e relazione tra mobilità, carica, campo elettrico applicato, dimensioni. Relazione tra punto isoelettrico e mobilità delle proteine. Elettroforesi su strisce di acetato di cellulosa (esempio: separazione di siero proteine e descrizione delle principali frazioni proteiche del siero); elettroforesi su gelo di poliacrilammide ( SDS-PAGE, elettroforesi su gelo con gradiente di reticolazione ). Determinazione del peso molecolare di proteine in elettroforesi.  Isoelettrofocalizzazione. Elettroforesi bidimensionale (applicazioni allo studio del proteoma). Elettroforesi di acidi nucleici. Elettroforesi capillare. Tecniche di trasferimento di macromolecole dai geli (Southern, Northern, Western Blot) con esempi di applicazioni diagnostiche. Metodiche di analisi della struttura delle proteine : struttura primaria e degradazione di Edman, determinazione di peso molecolare e sequenza con spettrometria di massa, metodiche utilizzate per la determinazione della struttura secondaria e terziaria (dicroismo circolare, cristallografia con raggi X, NMR). Proteomica e proteoma. Tecniche di biologia molecolare: sequenziamento del DNA con il metodo enzimatico di Sanger. Amplificazione del DNA mediante PCR.  PCR quantitativa e “real time” PCR. Utilizzo di banche dati per l’analisi e l’allineamento di sequenze. Enzimi di restrizione e mappe di restrizione. Analisi dei polimorfismi della lunghezza dei frammenti di restrizione, sonde molecolari e diagnostica molecolare. Clonazione del DNA: taglio con enzimi di restrizione, plasmidi ed altri vettori per la clonazione, selezione cellule trasformate, biblioteche genomiche e di cDNA. Espressione di proteine in procarioti ed eucarioti. Mutagenesi sitospecifica.  Microarray di DNA. Saggi immunologici. Nozioni su antigene e anticorpo, anticorpi monoclonali.. Sistemi di dosamento immunologico basati sulla marcatura di antigeni od anticorpi con isotopi radioattivi (RIA) e con enzimi (ELISA). Saggi di immunoprecipitazione; immunodiffusione semplice e radiale, immunoelettroforesi, rocket elettroforesi. Traccianti radioattivi. Nozioni sull’uso dei principali traccianti radioattivi utilizzati nel laboratorio biochimico e biochimico-clinico. Tipi di radiazioni; legge del decadimento radioattivo, tempo di dimezzamento. Unità di misura della radioattività. Strumentazione: contatori di Geiger-Mueller, contatori a scintillazione  (contatore a scintillatore solido e liquido ), autoradiografia.

Note

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