CORSO DI BIOCHIMICA PER C T F  

PROGRAMMA ANNO ACCADEMICO 2008/2009 

  

STRUTTURA DELLE PROTEINE 

Generalità sul riconoscimento molecolare. Panoramica sulle funzioni delle proteine. Gli amminoacidi delle proteine:, proprietà generali, famiglie di amminoacidi.  

Struttura primaria delle proteine. Il gruppo peptidico: legame peptidico e conformazioni dello scheletro polipeptidico, angoli di torsione φ e ψ. Diagramma di Ramachandran. Strutture secondarie: a elica e foglietto b. Motivi strutturali Le proteine fibrose. Proteine di membrana e globulari: struttura terziaria. I domini delle proteine globulari. Interazioni stabilizzanti e destabilizzanti nelle proteine. Effetto idrofobico. I ponti disolfuro. Struttura quaternaria. Il folding delle proteine in vitro e in vivo. Chaperon molecolari. Le malattie da misfolding. I prioni. Proteine coniugate e modificazioni post-traduzionali.  

LE PROTEINE CHE TRASPORTANO L'OSSIGENO 

II gruppo eme. Struttura e funzioni di mioglobina ed emoglobina. Affinità per l'ossigeno e per il CO. Curve di dissociazione dell'ossigeno: confronto tra mioglobina ed emoglobina. Effetto Bohr. Effetto del 2,3-bisfosfoglicerato. Emoglobina fetale. Emoglobina S.  Metaemoglobina. Trasporto della CO₂. Emoglobine patologiche. 

GLICIDI 

Funzioni dei glicidi. Classificazione. Monosaccaridi:aldosi e chetosi. Amminozuccheri, acido sialico e sialoglicoproteine. Zuccheri riducenti e non riducenti. Il legame glucosidico. Polisaccaridi: cellulosa, chitina, amido, glicogeno. Mucopolisaccaridi e mucopolisaccaridosi, eparina. Glicoproteine. Proteoglicani. Glicolipidi. I carboidrati come marcatori di superficie e recettori di segnali molecolari. 

LIPIDI E MEMBRANE BIOLOGICHE 

Definizione di "sostanze di natura lipidica". Ruoli biologici dei lipidi. Classificazione dei lipidi. Cere, triacilgliceroli, acidi grassi saturi e insaturi, glicerofosfolipidi, sfingolipidi, steroli e colesterolo, altri composti terpenici (vitamine A, D, E, K, ubichinone, dolicoli). I lipidi come segnali intracellulari (diacilglicerolo e ceramide) ed extracellulari (eicosanoidi). Architettura delle membrane biologiche: il modello a mosaico fluido e…il suo aggiornamento (lipid rafts). Fluidità delle membrane biologiche: effetto dei doppi legami e del colesterolo. Proteine di membrana: integrali, periferiche, monotopiche, GPI-anchored proteins.  

ENZIMI - PRINCIPI DI CATALISI 

Termodinamica delle reazioni: variazione di energia libera e costante di equilibrio. DG, DG⁰, DG^0I. Velocità di reazione e stato di transizione (equazione di Arrhenius: ΔG di attivazione). Classificazione degli enzimi. Catalisi non covalente e covalente. Teoria dello stato di transizione. Un esempio riepilogativo: le proteasi. Le proteasi a serina: meccanismo di reazione, specificità, attivazione degli zimogeni, esempi. I proteasomi. Le caspasi e l'apoptosi. Anticorpi catalitici. Ribozimi. 

ENZIMI - CINETICA ENZIMATICA - LE EQUAZIONI FONDAMENTALI 

Terminologia: velocità di reazione (v), velocità iniziale (v₀), costanti di velocità (k), costanti di equilibrio (K, di dissociazione e di associazione), dimensioni delle costanti, attività enzimatica e velocità, attività enzimatica specifica. La base sperimentale dell'equazione di Michaelis e Menten. Cinetica di saturazione: equazione e grafico. I modelli interpretativi dell’equazione sperimentale. Significato dei parametri cinetici: K_M, V_max e k_cat, k_cat / K_M; limiti superiori di k_cat / K_M ed enzimi "perfetti". Parametri cinetici degli enzimi regolatori e non regolatori: esempio della glicolisi. Effetto del pH e della temperatura sull'attività enzimatica. Rappresentazione grafica dei dati e determinazione dei parametri cinetici: equazione e grafico di Lineweaver-Burk (limiti e pregi).  

ENZIMI - INIBITORI E REGOLAZIONE 

Inibitori reversibili competitivi, acompetitivi, misti e non competitivi. Esempi di inibitori competitivi analoghi di substrato e di stato di transizione. Inibitori irreversibili: inibitori diretti al sito e inibitori suicidi (esempi). 

Controllo della disponibilità e dell’attività degli enzimi. Tipi di regolazione (esempi). Regolazione allosterica. Cooperatività: modello concertato e modello sequenziale. Attivatori e inibitoli allosterici. 

 

 

INTRODUZIONE AL METABOLISMO 

Generalità sul metabolismo. Processi catabolici e processi biosintetici. Termodinamica delle vie metaboliche: additività delle ΔG e accoppiamento delle reazioni. ATP: struttura, proprietà, tipo di reazioni ATP-dipendenti, vie di sintesi dell’ATP. Carica energetica della cellula. Metastabilità dell'ATP.  Composti ad elevato potenziale di trasferimento del fosfato. Composti ad "alta energia". Coenzimi e vitamine. Coenzima A, reattività dei tioesteri. NADH: reazioni "solite" (deidrogenazioni) e "insolite" (adenilazioni, ADP-ribosilazioni). NADPH: ruolo, distribuzione cellulare, confronto con il NADH. FAD, FMN e flavoproteine. Altri coenzimi derivanti da vitamine: lipoammide, piridossal fosfato, S-adenosil-metionina, tetraidrofolato, biotina, tiamina pirofosfato, coenzima B₁₂, metil-cobalamina. Acido ascorbico. Riepilogo sul controllo (termodinamico e cinetico) del flusso metabolico: tappe di controllo e minimizzazione dei cicli futili..

GLICOLISI

Generalità sul metabolismo dei carboidrati. La “dote” energetica di un metabolita (confronto tra glicidi e lipidi). Ruolo centrale del glucosio-6-fosfato. Reazioni ed enzimi della glicolisi. Meccanismo di reazione della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi. Termodinamica della glicolisi: DG⁰ e DG delle reazioni. Regolazione della glicolisi: enzimi regolatori e loro modulatori. Il fruttoso-2,6-bisfosfato e l'enzima tandem chinasi-fosfatasi. Sintesi del 2,3-bisfosfoglicerato. Destino del piruvato. Fermentazione lattica e alcolica.

CICLO DELL'ACIDO CITRICO (CICLO Di KREBS)

II complesso della piruvato deidrogenasi: reazioni, enzimi e coenzimi. Fonti metaboliche di acetil CoA. Reazioni ed enzimi del ciclo. Termodinamica e regolazione (ruolo di ATP e NADH). Ruolo catabolico e biosintetico del ciclo di Krebs. Reazioni anaplerotiche. Collegamento tra il ciclo di Krebs e le altre vie metaboliche. Il ciclo del gliossilato.

TRASPORTO DEGLI ELETTRONI E FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA

Potenziali redox e termodinamica delle reazioni di ossidoriduzione. I quattro complessi della catena respiratoria e i siti di accoppiamento. Ubichinone, citocromo c e altri citocromi, centri FeS, coenzimi flavinici. I fornitori di elettroni all'ubichinone. Accoppiamento tra flusso degli elettroni e fosforilazione ossidativa. Sintesi dell'ATP: ipotesi chemiosmotica. Struttura e funzione dell'ATP sintasi. Il disaccoppiamento. Inibitori della catena respiratoria. Sistemi navetta per il trasporto degli elettroni del NADH citosolico. Citocromo c  e apoptosi.

VIA DEI PENTOSO FOSFATI

Generalità e confronto con la glicolisi. Corredo enzimatico della via dei pentoso fosfati: fase ossidativa e fase non ossidativa. Quattro "scenari metabolici" legati al fabbisogno di NADPH, riboso-5-fosfato e ATP. Fonti di NADPH alternative alla via dei pentosi: enzima malico. NADPH e glutatione reduttasi. Favismo e altre carenze di glucoso-6-fosfato deidrogenasi. Funzioni del NADPH.

METABOLISMO DEL GLICOGENO

Struttura e funzione del glicogeno. Demolizione del glicogeno: scissione fosforolitica, enzimi deramificanti. Fosfoglucomutasi e destino del glucoso-6-fosfato. Sintesi del glicogeno da UDP-glucoso. Sintesi dell'UDP-glucoso: ruolo della pirofosfatasi inorganica. Enzima ramificante. Regolazione del metabolismo del glicogeno. Il calcio e la calmodulina.

GLUCONEOGENESI

Generalità: il glucosio….ad ogni costo! II glucosio da precursori non glicidici: glicerolo, alanina-piruvato, amminoacidi (ruolo-cerniera del ciclo di Krebs). Confronto tra glicolisi e gluconeogenesi. La piruvato carbossilasi, un enzima polifunzionale. Gli altri enzimi "peculiari" della gluconeogenesi: PEP-carbossichinasi, fruttoso-l,6-bisfosfatasi e glucoso-6-fosfatasi. Il ciclo di Cori.

METABOLISMO LIPIDICO - GLI ACIDI GRASSI

Degradazione e sintesi dei triacilgliceroli nel duodeno, negli adipociti e nel fegato. Destino metabolico di glicerolo e acidi grassi. Degradazione degli acidi grassi. Attivazione degli acidi grassi e trasferimento nella matrice mitocondriale. La b-ossidazione: reazioni, enzimi e coenzimi. Bilancio energetico della b-ossidazione. Ossidazione degli acidi grassi a catena dispari di atomi di carbonio. La chetogenesi e i corpi chetonici.

Sintesi degli acidi grassi: confronto con la b-ossidazione. Trasporto di equivalenti di acetil-CoA dal mitocondrio al citosol: ruolo del citrato e dell'enzima malico. La acetil-CoA carbossilasi: confronto con altri biotin-enzimi. Organizzazione strutturale della acido grasso sintasi animale. Reazioni della sintesi degli acidi grassi. Le prostaglandine. Regolazione del metabolismo degli acidi grassi.

METABOLISMO LIPIDICO - I LIPIDI DI MEMBRANA E IL COLESTEROLO

Il metabolismo dei fosfolipidi (cenni). Il metabolismo degli isoprenoidi in procarioti ed eucarioti: ramificazioni principali. Generalità sulla biosintesi del colesterolo: localizzazione cellulare, diramazioni, fabbisogno di NADPH e ATP (costi di produzione e costi di trasporto). HMG-CoA reduttasi e sintesi del mevalonato, trasformazione del mevalonato nell'unità isoprenica attivata, sintesi dello squalene e sua ossidazione, ciclizzazione dello squalene epossido (esempi di ciclasi animali e vegetali), trasformazione del lanosterolo in colesterolo (ruolo delle monossigenasi). Le lipoproteine. Il controllo della biosintesi e del trasporto del colesterolo. L'ipercolesterolemia famigliare. Vecchi e nuovi inibitori della biosintesi del colesterolo. Derivati del colesterolo: ormoni steroidei (glucocorticoidi, mineralcorticoidi, sessuali), acidi biliari, vitamina D₃. Meccanismo d'azione degli ormoni steroidei. Biosintesi degli ormoni steroidei: ruolo delle monoossigenasi. La prenilazione delle proteine: le Ras-farnesil transferasi.

METABOLISMO DEGLI AMMINOACIDI - CATABOLISMO

II catabolismo delle proteine della dieta e cellulari. Il sistema ubiquitina-proteasoma. Le proteine come riserva “remota” di glucosio. Destino metabolico degli amminoacidi: amminoacidi glucogenici e chetogenici. Deamminazione per transamminazione: meccanismo catalitico. Altre reazioni PLP-dipendenti. Deamminazione ossidativa: la glutamico deidrogenasi. Ruolo catalitico dell'a-chetoglutarato. Eliminazione dell'azoto: organismi ammoniotelici, uricotelici e ureotelici. Sintesi mitocondriale del carbammilfosfato. Ciclo dell'urea: reazioni ed enzimi. Collegameno tra il ciclo dell'urea e il ciclo di Krebs.  Il ruolo centrale del glutammato nel metabolismo azotato. Compartimentazione cellulare e regolazione del ciclo dell’urea.

METABOLISMO DEGLI AMMINOACIDI - BIOSINTESI

Biogenesi dell'azoto organico: glutammato deidrogenasi, glutammina sintetasi. Amminoacidi essenziali e non essenziali. Caratteristiche generali della biosintesi degli amminoacidi. Famiglie biosintetiche degli amminoacidi. Sintesi per transamminazione da a-chetoacidi. Interconversione serina-glicina (enzima serina idrossimetil transferasi). Il metabolismo delle unità monocarboniose: i derivati del tetraidrofolato e la S-adenosil metionina. La metilcobalamina. Schema generale del metabolismo delle unità monocarboniose. Biosintesi della tirosina dalla fenilalanina: ruolo della biopterina. Fenilchetonuria e alcaptonuria. Biomolecole da amminoacidi (strutture, funzioni e aspetti biosintetici comuni). Arginina e NO.

METABOLISMO DEI NUCLEOTIDI

Funzioni dei nucleotidi. Struttura di nucleotidi, nucleosidi, basi puriniche e pirimidiniche. Aspetti generali del metabolismo dei nucleotidi: vie de novo e vie di recupero. Il 5-fosforibosilpirofosfato (PRPP), metabolita chiave delle vie biosintetiche dei nucleotidi. Origine degli atomi degli anelli purinico e pirimidinico e strategie biosintetiche. AMP e GMP da IMP. Formazione dei deossiribonucleotidi: la ribonucleotide reduttasi. Timidilato sintasi: meccanismo di reazione, inibitori, associazione funzionale con la diidrofolato reduttasi. Ipotesi sulla funzione del 5-metile nella timina. Recupero e degradazione dei nucleotidi. Riepilogo sull’intreccio metabolico tra amminoacidi e nucleotidi.

 

CASCATE DI SEGNALAZIONE MOLECOLARE E INTEGRAZIONE DEL METABOLISMO

Segnali molecolari e apparati di interpretazione: generalità, recettori di membrana e recettori nucleari. Proteine G: proprietà generali e classi. Fattori traduzionali (v. anche: sintesi delle proteine - traduzione). Proteine Ras. Proteine G eterotrimeriche:  struttura, classi, ciclo funzionale, cascate inibitorie e stimolatorie dell'AMPc, adenilato ciclasi, fosfodiesterasi (confronto con la cascata del cGMP), proteina chinasi A, tossine. Cascate del PIP₂. Recettori-enzimi. Guanilato ciclasi di membrana e solubile. RTKs (receptors tyrosine kinases). Recettore dell'insulina e simili. Gli oncogèni e gli oncosoppressori.

STRUTTURA DEGLI ACIDI NUCLEICI

Basi puriniche e pirimidiniche di DNA e RNA: forme tautomeriche e loro attitudine alla formazione di legami H. Differenze "chimiche" tra DNA e RNA. Rare Nucleic acid Components (RNC): esempi (basi modificate e altro), metilazioni e protezione da enzimi di restrizione. Struttura di un filamento polinucleotidico. La struttura a doppia elica del DNA. Regola di Chargaff. Appaiamenti standard tra le basi, appaiamenti fra tautomeri rari, impilamento delle basi, solchi maggiore e minore. DNA B, A e Z. Forze che stabilizzano la doppia elica del DNA. Il DNA a tripla elica. Denaturazione del DNA. Temperatura di fusione: dipendenza dalla percentuale di G--C. Topologia del DNA. Il DNA superavvolto e le topoisomerasi. Composizione della cromatina: gli istoni e i nucleosomi. Stabilità evolutiva degli istoni. Acidi ribonucleici: mRNA, tRNA, Rrna, microRNA, RNA virali..

REPLICAZIONE DEL DNA

Caratteristiche generali della replicazione: semiconservatività (esperimento di Meselson e Stahl), bidirezionallità (esperimenti con timidina triziata), unicità di origine nei procarioti (esperimenti con batteri in rapida crescita), semidiscontinuità (esperimenti di Okazaki). Le DNA polimerasi: meccanismo generale di reazione. Apparato di replicazione nei procarioti: elicasi, SSBP, primasi, DNA polimerasi III, DNA polimerasi I, DNA ligasi, topoisomerasi (girasi). La replicazione negli eucarioti. La trascrittasi inversa.

CODICE GENETICO E RNA DI TRASPORTO

Definizione di gene. Definizione e caratteristiche del codice genetico: triplette non sovrapposte (eccezione: virus), univocità, universalità, ridondanza, ridondanza ordinata. Origine del codice genetico. Decifrazione (esperimenti iniziali). L'RNA transfer: strutture primaria e secondaria, basi modificate, struttura terziaria. Le amminoacil-tRNA sintetasi: attivazione dell'amminoacido e caricamento sul tRNA. Classi I e II di amminoacil-tRNA sintetasi. Fedeltà del processo di caricamento dell'aminoacido sul tRNA. Appaiamento codone-anticodone. Appaiamenti oscillanti (esempio della leucina). Mutazioni di senso, non senso, di cornice di lettura. Mutazioni puntiformi (sostituzione, delezioni, inserzioni). Formazione di tautomeri rari. Dimeri di timina, 5Br-uracile, 2-NH₂-purina. Esempi di riparazione del DNA.

SINTESI DELLE PROTEINE (LA TRADUZIONE)

Composizione, struttura e localizazione cellulare dei ribosomi di eucarioti e procarioti. Ruolo dei fattori GTPasici nella sintesi delle proteine. Sintesi di fMet-tRNA e fase di inizio nei procarioti. Fase di allungamento: ruolo di EF-Tu, EF-Ts, EFG, formazione del legame peptidico, traslocazione. Fase di terminazione. Costo energetico della sintesi delle proteine. Sintesi delle proteine negli eucarioti e sua regolazione (cenni). Inibitori della sintesi delle proteine: antibiotici, tossine.

SINTESI E MATURAZIONE DELL'RNA (LA TRASCRIZIONE)

Le RNA polimerasi DNA dipendenti (trascrittasi). Struttura dell'RNA polimerasi dei procarioti. Siti promotori in procarioti ed eucarioti, filamenti senso e antisenso. Sintesi dell'RNA su stampo di DNA: inizio, allungamento, terminazione. Reattività dell'RNA e proprietà catalitiche. Maturazione del precursore del tRNA: la ribonucleasi P. Maturazione del precursore dell'rRNA, scoperta dell'autosplicing. Autosplicing e introni di tipo I e II. Maturazione del precursore del mRNA: formazione del cappuccio, metilazioni, poliadenilazione, rimozione degli introni. Discontinuità dei geni degli eucarioti (introni ed esoni): esperimenti di ibridazione DNA-mRNA. Gli spliceosomi e il processo di splicing: meccanismo, accuratezza, confronto con l'autosplicing. Splicing alternativo: morte dell’assioma “un gene, una proteina”. Ipotesi sull'origine degli introni. Editing dell’mRNA: esempio dell’apolipoproteina B. Riepilogo su trascrizione e traduzione in procarioti ed eucarioti.

REGOLAZIONE DELL'ESPRESSIONE GENICA IN PROCARIOTI ED EUCARIOTI

mRNA policistronico dei procarioti. Operon catabolici e biosintetici. Induzione enzimatica. Proteine regolatrici (repressori e attivatori), effettori (induttori e corepressori). Il lac-operon: esperimenti di Monod, il modello di Monod e il modello attuale, il complesso cAMP-CAP. Il Trp-operon e il meccanismo di attenuazione. Regolazione dell'espressione genica negli eucarioti: repressione da parte dei nucleosomi, fattori di trascrizione (attivatori e repressori), coattivatori e corepressori, acetilazione e deacetilazione degli istoni, complessi che rimodellano la cromatina, le tre RNA polimerasi degli eucarioti, RNA polimerasi II, fattori generali di trascrizione, il complesso del mediatore. Il silenziamento genico post-trascrizionale e l’RNAi. L’«altro» genoma: l’enigma del DNA-spazzatura.