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Oggetto:
Oggetto:

Biochimica applicata (CTF)

Oggetto:

Applied biochemistry

Oggetto:

Anno accademico 2021/2022

Codice attività didattica
FAR0025
Docente
Prof. Salvatore Adinolfi (Titolare del corso)
Corso di studio
[f003-c504] laurea magistrale in chimica e tecnologia farmaceutiche - a torino
Anno
2° anno
Periodo
Da definire
Tipologia
Caratterizzante
Crediti/Valenza
6
SSD attività didattica
BIO/10 - biochimica
Erogazione
Tradizionale
Lingua
Italiano
Frequenza
In parte obbligatoria
Tipologia esame
Orale
Prerequisiti
chimica organica, biochimica
Oggetto:

Sommario del corso

Oggetto:

Obiettivi formativi

acquisizione delle conoscenze di base circa le metodologie applicate nella sperimentazione biochimica e biochimica clinica con particolare attenzione per la logica dell'impostazione degli esperimenti e della raccolta dati

Scopes and objectives: 

The course covers the description of key methods used in biochemistry, and clinical biochemistry. In particular, the logic of experimental design and data analysis is emphasized.

Oggetto:

Risultati dell'apprendimento attesi

Gli studenti dovrebbero acquisire le conoscenze di base delle principali metodiche e strumentazione utilizzate nei laboratori biochimici e di analisi cliniche ed essere in grado di progettare esperimenti e risolvere i problemi pratici relativi all'identificazione, analisi e studio di funzioni delle biomolecole

In maggior dettaglio:

CONOSCENZA E CAPACITA' DI COMPRENSIONE Aquisizione di conoscenze teoriche e operative relative alla biochimca di base con specifico riferimento alle tecniche applicate per la ricerca biochimica  

CAPACITA' DI APPLICARE CONSCENZA E COMPRENSIONE Aquisizione della capacita di applicare le conoscenze teoriche relatiove alla biochimica applicata per risolvere esercizi e problemi con speicfico riferimento alle tecniche applicate per la ricerca biologica 

AUTONOMIA DI GIUDIZIO Aquisizione di consapevole autonomia di giudizio per valutare problematiche biochimiche in ambito della ricerca farmaceutica 

ABILITA' COMUNICATIVE Aquisire strumenti validi per poter comunicare, a secodna del contesto, le proprie conoscenze  supportate con adeguati riferimenti scientifici. 

CAPACITA' DI APPRENDIMENTO Aquisizione di capacita' autonome di apprendimento che permettino un autovalutazione delle proprie preparazione che permettera' di proseguire gli studi sempre con maggior autonomia  

 

Results expected: the students, on the basis of the learning of the basic methods and laboratory tools used in biochemistry, will be able to plan experiments and resolve practical problems related to identification, analysis and study of the functions of bio molecules.

n more detail:

KNOWLEDGE AND UNDERSTANDING Acquisition of theoretical and operational knowledge relating to basic biochemistry with specific reference to applied techniques for biochemical research

APPLYING CONSCIOUSNESS AND UNDERSTANDING Acquisition of the ability to apply theoretical knowledge relating to applied biochemistry to solve exercises and problems with speicphic reference to applied techniques for biological research

MAKING JUDGMENT Acquisition of conscious autonomy of judgment to evaluate biochemical problems in the field of pharmaceutical research

COMMUNICATION SKILLS Acquire valid tools to be able to communicate, according to the context, one's knowledge supported with adequate scientific references.

LEARNING SKILLS Acquisition of autonomous learning skills that allow a self-assessment of one's own preparation that will allow them to continue their studies with greater autonomy

Oggetto:

Programma

Programma  CFU 5

Introduzione alle metodologie biochimiche

Biochimica e' una scienza sperimentale, progettazione di esprimenti.

Enzimologia e inibizione

Enzimi come catalizzatori biologici e loro caratteristiche chimiche, coenzimi e gruppi prostetici, siti attivi (teorie della chiave serratura e dell'induce fit), barriera energetica, Cineitche enzimatiche di saturazione, ruolo del complesso ES, equazione di Michaelis e Menten, I significati di Km e Vmax, grafici del doppio reciproco, Inibizione competitiva, non competitiva e acompetitiva, ruolo de pH, allosteria

 Preparazione e manipolazione di campioni biologici.

Uso e preparazione di soluzioni tampone. Rottura di cellule; preparazione e purificazione di organelli cellulari; centrifugazione: centrifughe, rotori, centrifugazione differenziale e di isodensità all'equilibrio con esempi applicativi (separazione di organelli cellulari, purificazione di acidi nucleici in gradiente di sali). 

 Colture cellulari.

Colture primarie, secondarie, linee. Metodiche colturali. Tecniche cromatografiche ed elettroforetiche applicate all'isolamento, alla purificazione e all'analisi di sostanze di interesse biochimico e biochimico-clinico.  

Procedure preliminari per la purificazione delle proteine

 considerazioni generali (resa di una purificazione), metodi di omogeneizzazione dei tessuti (metodi meccanici e non), precipitazione frazionata delle proteine (salting in and salting out)

 Metodologie per la purificazione delle proteine: Tecniche cromatografiche:

Generalità e definizioni.  Caratteristiche ed applicazioni delle cromatografie: di scambio ionico, di esclusione dimensionale (con esempi di determinazione del peso molecolare di proteine), di bioaffinità (con esempi di ligandi e strategie generali per il legame covalente dei ligandi alla fase stazionaria), di interazione idrofobica, di chelazione.

 Tecniche per l'analisi di proteine: Tecniche elettroforetiche:

principi generali: concetto di mobilità elettroforetica e relazione tra mobilità, carica, campo elettrico applicato, dimensioni. Relazione tra punto isoelettrico e mobilità delle proteine. Elettroforesi su strisce di acetato di cellulosa e separazione di siero proteine, tracciati patologici; elettroforesi su gel di poliacrilammide ( SDS-PAGE).  Tecniche di trasferimento di macromolecole dai gel (in particolare la tecnica del Western Blot). Isoelettrofocalizzazione. Elettroforesi bidimensionale (applicazioni allo studio del proteoma). Elettroforesi di acidi nucleici.                                                

 Metodi spettrofotometrici

Per lo studio delle molecole biologiche ed in enzimologia: generalità e definizioni. Spettri di assorbimento con esempi di spettri di molecole di interesse biochimico: proteine, acidi nucleici, NAD, citocromo c, citocromo P-450. Legge di Lambert-Beer e dosamenti quantitativi. Esempi di dosamenti: dosamento delle proteine e di enzimi: unità di attivita' enzimatica, attività specifica, fattore di arricchimento durante una purificazione. Saggi enzimatici in cinetica ed a tempo fisso.  Esempi di determinazione di attività enzimatiche    Fluorimetria ed applicazioni in biochimica e microscopia delle cellule e tessuti. Luminometria e sistema luciferina-luciferasi. Dosamento spettrofotometrico del DNA.

Principi di base della risonanza magnetica nucleare e della sua applicazione con le proteine.

Esempi di purificazione di proteine

Purificazione della DNA polimrasi da Thermus aquaticus, purificazione da Escherichia coli,

purificazione usando his-tag, purificazione di proteine da membrana, purificazione da organi e dalle cellule di mammifero HEK293

 Saggi immunologici.

Nozioni su antigene e anticorpo, anticorpi monoclonali e loro preparazione. Sistemi di dosamento immunologico basati sulla immunoprecipitazione e sulla marcatura di antigeni od anticorpi con enzimi (ELISA) e (RIA).

Metodi biochimici nell'analisi delle interazioni molecolari

Equilibri di legami, legame ad un unico sito, la competizione di legame, il legame non specifico, la cinetica di legame, analisi sperimentale degli equilibri di legame (metodi spettroscopici, metodi basati sulla separazione molecolare, risonanza plasmonica di superficie)

Metodi per l'analisi delle interazioni proteina-proteina

Cromatografia di affinita', co-immunoprecipitazione, cross-linking, cenni sui metodi generici

Microarray e sue applicazioni 

 metodo che permette di valutare il profilo di espressione di migliaia gi gene simultaneamente per studiare l'effetto di certi ttattamenti, malattie.

 

APPLIED BIOCHEMISTRY  CTF  CFU 5

 

Program: 

Protein purification methodology

 General principals, homogenisation methods of tissues, salting in and salting out 

 

 How to prepare and use biological samples.- Buffer solution- origin of biological samples- Tissue and cell homogenisation- centrifugation and separation of cellular organelles and macromolecules (differential and isopicnic centrifugation with practical examples).- how to store biological samples.-- Mammalian cell culture.

Enzymology and inhibition

Enzyme: general principals, coenzymes and prosthetic groups, active sites (different theories),energetic barrier, enzymatic kinetics of saturation, ES complex role, Michaelis and Menten equation, Km and Vmax, competitive, non-competitive and acompetitive inhibition, enzymatic activity and pH , allosteric regulation 

Cell culture:-primary and secondary culture, cell lines, culture methods.

Spectrophotometer methods for protein, enzymes and nucleic acid studies:- general principles and definitions. Lamber -Beer law. Examples of absorption spectra of biological molecules: proteins, nucleic acids, NAD, hemoproteins.- Functions and catalytic mechanism of P-450.- protein (absorbance at l 280, Lowry and biuret methods).- enzyme assays: rate of enzyme-catalyzed reactions and enzyme concentration, units of enzyme activity, specific activity. Examples of enzyme assays: cytochrome c reductase, malate dehydrogenase, maltase, proteases, aminotransferases. Enzymes as reagents: enzymatic assay of cholesterol and glucose.-fluorometry: examples of biochemical applications and application in cell biology (microscopy).- Spectrophotometer assay of DNA and melting curve of DNA.

Chromatography and electrophoresis for proteins and nucleic acids:- general principles and definitions in chromatography.- ion exchange, gel filtration, hydrophobic, affinity, metal-chelate affinity, covalent chromatography.- protein purification strategies.- general principles of electrophoresis, isoelectric point and protein mobility.- serum proteins and separation in cellulose acetate electrophoresis, pathologic curves.- SDS PAGE and isoelectrofocusing.- two-dimensional electrophoresis .- nucleic acid electrophoresis.- capillary electrophoresis.-  

Protein purification examples  

DNA polymerase purification from Thermus aquaticus and from E. coli,

his-tag carrier

 

immunoassay.

Antibody and antigen, production of monoclonal antibody. Immunoassay: immunoprecipitation and by antigen radiolabelling or antibody conjugated with enzymes (RIA) and (ELISA).

 

Biochemical methods to study molecular interaction.

 

Methods for protein-protein interaction analysis 

RNA-Microarray 

Method that study the gene expression profiling levels of thousands of genes simultaneously to evaluate the effects of certain treatments and or diseases,

 

Practice exercises in laboratory on protein electrophoresis and chromatography, and enzyme activity and kinetics.  

 

Oggetto:

Modalità di insegnamento

L'insegnamento si aritcola in 40 ore di lezioni teoriche non obligatorie. E obligatorio la frequenza del laboratorio. sono previsti momenti di interazione e confronto con gli studenti/studentesse in presenza, o qualora fosse richiesto in remoto. Come supporto vi e l'accesso alle slides delle lezioni cosi come gli esercizi dimostrativi e pratici in laboratorio su elettroforesi e cromatografia di proteine, determinazione attività enzimatica e costanti cinetiche.

Oggetto:

Modalità di verifica dell'apprendimento

L'esame puo' essere scritto e/o orale e puo' essere erogato in remoto per esigenze certificate. In genere all'esame verrano richieste 3 domande sugli argomenti trattati a lezione e in laboratorio. Il voto finale terra' conto della relazione scritta sull'esperienze svolte in laboratorio (che sara' valutata da 0 a 3punti)

 

Testi consigliati e bibliografia



Oggetto:
Libro
Titolo:  
BIOchimica applicata
Editore:  
EdiSES
Autore:  
Stoppini M, Bellotti V.
Obbligatorio:  
No
Oggetto:

D.L. Nelson, M.M Cox. I principi di Biochimica di Lehninger - Zanichelli, 6 edizione

M.C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M.L. Di Salvo- Metodologie biochimiche- CEA

 

Saranno a disposizione le slides del corso fornite dal docente 



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    Ultimo aggiornamento: 05/11/2021 15:05

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